O veneno de cobra contém enzimas que hidrolisam as ligações éster carboxílico.Os substratos para hidrólise são fosfolipídios, acetilcolina e acetato aromático.Essas enzimas incluem três tipos: fosfolipase, acetilcolinesterase e esterase aromática.A arginina esterase no veneno de cobra também pode hidrolisar arginina ou lisina sintética, mas hidrolisa principalmente ligações peptídicas de proteínas na natureza, por isso pertence à protease.As enzimas discutidas aqui atuam apenas em substratos de éster e não podem atuar em nenhuma ligação peptídica.Dentre essas enzimas, as funções biológicas da acetilcolinesterase e da fosfolipase são as mais importantes e já foram amplamente estudadas.Alguns venenos de cobra têm forte atividade de esterase aromática, que pode hidrolisar p-nitrofenil etil éster, acetato de a- ou P-naftaleno e éster etílico de indol.Ainda não se sabe se essa atividade é produzida por uma enzima independente ou um efeito colateral conhecido da carboxilesterase, sem falar em seu significado biológico.Quando o veneno de Agkistrodon halys Japonicus foi reagido com p-nitrofenil etil éster e indol etil éster, os hidrolisados de p-nitrofenol e indol fenol não foram encontrados;Pelo contrário, se esses ésteres reagirem com veneno de cobra Zhoushan subespécie de cobra e veneno de cobra Bungarus multicinctus, eles serão rapidamente hidrolisados.Sabe-se que esses venenos de cobra têm forte atividade de colinesterase, que pode ser responsável pela hidrólise dos substratos acima.De fato, Mclean et al.(1971) relataram que muitos venenos de cobra pertencentes à família Cobra podem hidrolisar éster etílico de indol, éster etílico de naftaleno e éster de butil naftaleno.Esses venenos de cobra vêm de: cobra, cobra de pescoço preto, cobra de lábios pretos, cobra dourada, cobra egípcia, cobra real, mamba de cobra dourada, mamba negra e mamba de lábios brancos (D. aw ainda conhece a cascavel rombola oriental
O veneno de cobra pode hidrolisar o éster etílico de metil indol, que é o substrato para determinar a atividade da colinesterase no soro, mas esse veneno de cobra não apresenta atividade de colinesterase.Isso mostra que existe uma esterase desconhecida no veneno de cobra, que é diferente da colinesterase.Para entender a natureza dessa enzima, é necessário mais trabalho de separação.
1, Fosfolipase A2
(I) Visão geral
A fosfolipase é uma enzima que pode hidrolisar o gliceril fosfato.Existem 5 tipos de fosfolipase na natureza, ou seja, fosfolipase A2 e fosfolipase
A. , fosfolipase B, fosfolipase C e fosfolipase D. O veneno de cobra contém principalmente fosfolipase A2 (PLA2), alguns venenos de cobra contêm fosfolipase B e outras fosfolipases são encontradas principalmente em tecidos animais e bactérias.A Fig. 3-11-4 mostra o local de ação dessas fosfolipases na hidrólise do substrato.
Dentre as fosfolipases, a PLA2 tem sido a mais estudada.Pode ser a enzima mais estudada no veneno de cobra.Seu substrato é a ligação éster na segunda posição do Sn-3-glicerofosfato.Esta enzima é amplamente encontrada em veneno de cobra, veneno de abelha, veneno de escorpião e tecidos animais, e a PLA2 é abundante em quatro venenos de serpentes da família.Como essa enzima quebra os glóbulos vermelhos e causa hemólise, ela também é chamada de “hemolisina”.Algumas pessoas também chamam de lecitinase hemolítica PLA2.
Ludeeke descobriu pela primeira vez que o veneno de cobra pode produzir um composto hemolítico agindo na lecitina por meio de enzimas.Mais tarde, Delezenne et al.provou que quando o veneno de cobra age no soro ou gema de cavalo, forma uma substância hemolítica.Sabe-se agora que a PLA2 pode atuar diretamente nos fosfolipídios da membrana eritrocitária, destruindo a estrutura da membrana eritrocitária e causando hemólise direta;Também pode atuar no soro ou na lecitina adicionada para produzir lecitina hemolítica, que atua nas hemácias para produzir hemólise indireta.Embora a PLA2 seja abundante nas quatro famílias de venenos de cobra, o conteúdo de enzimas em vários venenos de cobra é ligeiramente diferente.Cascavel (C
O veneno de cobra mostrou apenas atividade fraca de PLA2.A Tabela 3-11-11 ilustra a comparação da atividade de PLA2 de 10 principais venenos de cobras venenosas na China.
Tabela 3-11-11 Comparação das atividades da fosfolipase VIII de 10 venenos de cobra na China
Veneno de cobra
liberação de gordura
ácido alifático,
Cjumol/mg)
Atividade hemolítica CHU50/^ g * ml)
Veneno de cobra
Libera ácidos graxos
(^raol/mg)
Atividade hemolítica “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
onze
Micracephal ophis
cinco vírgula um zero
kalyspallas
8. 68
dois mil e oitocentos
gracilis
V, agudo
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
três vírgula oito dois
cento e quarenta
Bnugarus fasctatus
7,56
duzentos e oitenta
B. multicinctus
um ponto nove seis
duzentos e oitenta
Viper a russelli
sete vírgula zero três
T, mucosquamatus
um ponto oito cinco
Siamense
T. stejnegeri
0. 97
(2) Separação e purificação
O conteúdo de PLA2 no veneno de cobra é grande e é estável ao calor, ácido, álcali e desnaturante, de modo que é fácil purificar e separar o PLA2.O método comum é primeiro realizar a filtração em gel no veneno bruto, depois realizar a cromatografia de troca iônica e a próxima etapa pode ser repetida.Deve-se notar que a liofilização da PLA2 após a cromatografia de troca iônica não deve causar agregação, porque o processo de liofilização geralmente aumenta a força iônica no sistema, que é um fator importante que causa a agregação da PLA2.Além dos métodos gerais acima, também foram adotados os seguintes métodos: ① Wells et al.② O substrato análogo de PLA2 foi usado como ligante para cromatografia de afinidade.Este ligante pode se ligar à PLA2 no veneno de cobra com Ca2+.O EDTA é usado principalmente como eluente.Após a remoção do Ca2+, a afinidade entre a PLA2 e o ligante diminui e ela pode ser dissociada do ligante.Outros usam solução orgânica a 30% ou uréia 6mol/L como eluente.③ A cromatografia hidrofóbica foi realizada com PheiiylSephar0SeCL-4B para remover vestígios de PLA2 na cardiotoxina.④ Anticorpo anti PLA2 foi usado como ligante para realizar cromatografia de afinidade em PLA2.
Até agora, um grande número de PLAZ de veneno de cobra foi purificado.Tu et al.(1977) listou PLA2 purificado de veneno de cobra antes de 1975. Nos últimos anos, um grande número de artigos sobre separação e purificação de PLA2 foi relatado todos os anos.Aqui, nos concentramos na separação e purificação do PLA por estudiosos chineses.
Chen Yuancong et ai.(1981) separaram três espécies de PLA2 do veneno de Agkistrodon halys Pallas em Zhejiang, que podem ser divididas em PLA2 ácida, neutra e alcalina de acordo com seus pontos isoelétricos.De acordo com sua toxicidade, a PLA2 neutra é mais tóxica, que foi identificada como neurotoxina pré-sináptica Agkistrodotoxina.A PLA2 alcalina é menos tóxica e a PLA2 ácida quase não tem toxicidade.Wu Xiangfu et ai.(1984) compararam as características de três PLA2s, incluindo peso molecular, composição de aminoácidos, N-terminal, ponto isoelétrico, estabilidade térmica, atividade enzimática, toxicidade e atividade hemolítica.Os resultados mostraram que eles tinham peso molecular e estabilidade térmica semelhantes, mas tinham diferenças significativas em outros aspectos.No aspecto da atividade enzimática, a atividade enzimática ácida foi maior que a atividade enzimática alcalina;O efeito hemolítico da enzima alcalina nas hemácias de rato foi o mais forte, seguido pela enzima neutra e pela enzima ácida dificilmente hemolisada.Portanto, especula-se que o efeito hemolítico do PLAZ esteja relacionado à carga da molécula de PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) produziram cristais de Agkistrodotoxina.Tu Guangliang et ai.(1983) relataram que um PLA tóxico com ponto isoelétrico de 7,6 foi isolado e purificado do veneno de Vipera rotundus de Fujian, e suas propriedades físicas e químicas, composição de aminoácidos e a sequência de 22 resíduos de aminoácidos no N -terminal foram determinados.Li Yuesheng e outros.(1985) isolaram e purificaram outra PLA2 do veneno de Viper rotundus em Fujian.A subunidade da PLA2 * é 13 800, o ponto isoelétrico é 10,4 e a atividade específica é 35/xnioI/miri mg。 Com a lecitina como substrato, o pH ideal da enzima é 8,0 e a temperatura ideal é 65 ° C LD5 injetado por via intravenosa em camundongos.É 0,5 ± 0,12 mg/kg.Esta enzima tem efeitos anticoagulantes e hemolíticos óbvios.A molécula tóxica PLA2 consiste em 123 resíduos de 18 tipos de aminoácidos.A molécula é rica em cisteína (14), ácido aspártico (14) e glicina (12), mas contém apenas uma metionina, e seu N-terminal é um resíduo de serina.Em comparação com a PLA2 isolada por Tuguang, o peso molecular e o número de resíduos de aminoácidos das duas isoenzimas são muito semelhantes, e a composição de aminoácidos também é muito semelhante, mas o número de resíduos de ácido aspártico e prolina é um pouco diferente.O veneno da cobra-rei de Guangxi contém PLA2 rico.Shu Yuyan e outros.(1989) isolaram uma PLA2 do veneno, que possui atividade específica 3,6 vezes maior que o veneno original, peso molecular de 13.000, composição de 122 resíduos de aminoácidos, ponto isoelétrico de 8,9 e boa estabilidade térmica.A partir da observação do microscópio eletrônico do efeito da PLA2 básica nos glóbulos vermelhos, pode-se ver que tem efeito óbvio na membrana dos glóbulos vermelhos humanos, mas não tem efeito óbvio nos glóbulos vermelhos da cabra.Este PLA2 tem um efeito de retardo óbvio na velocidade eletroforética dos glóbulos vermelhos em humanos, cabras, coelhos e porquinhos-da-índia.Chen et ai.Essa enzima pode inibir a agregação plaquetária induzida por ADP, colágeno e ácido araquidônico sódico.Quando a concentração de PLA2 é 10/xg/ml~1OOjug/ml, a agregação plaquetária é completamente inibida.Se plaquetas lavadas fossem usadas como materiais, PLA2 não poderia inibir a agregação na concentração de 20Mg/ml.A aspirina é um inibidor da ciclooxigenase, que pode inibir o efeito da PLA2 nas plaquetas.A PLA2 pode inibir a agregação plaquetária ao hidrolisar o ácido araquidônico para sintetizar o tromboxano A2.A conformação da solução de PLA2 produzida pelo veneno de Agkistrodon halys Pallas na província de Zhejiang foi estudada por meio de dicroísmo circular, fluorescência e absorção de UV.Os resultados experimentais mostraram que a conformação da cadeia principal dessa enzima era semelhante à do mesmo tipo de enzima de outras espécies e gêneros, a conformação do esqueleto tinha boa resistência ao calor e a mudança estrutural em meio ácido era reversível.A combinação do ativador Ca2+ e da enzima não afeta o ambiente dos resíduos de triptofano, enquanto o inibidor Zn2+ faz o contrário.A maneira como o valor do pH da solução afeta a atividade enzimática é diferente dos reagentes acima.
No processo de purificação de PLA2 de veneno de cobra, um fenômeno óbvio é que um veneno de cobra contém dois ou mais picos de eluição de PLA2.Este fenômeno pode ser explicado da seguinte forma: ① devido à existência de isoenzimas;② Um tipo de PLA2 é polimerizado em uma variedade de misturas de PLA2 com vários pesos moleculares, a maioria dos quais está na faixa de 9.000~40.000;③ A combinação de PLA2 e outros componentes do veneno de cobra complica a PLA2;④ Como a ligação amida na PLA2 é hidrolisada, a carga muda.① E ② são comuns, com apenas algumas exceções, como PLA2 em CrWa/w veneno de cobra
Existem duas situações: ① e ②.A terceira condição foi encontrada em PLA2 no veneno das seguintes cobras: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, víbora palestina, víbora da areia e terrível cascavel km。
O resultado do caso ④ faz com que a velocidade de migração da PLA2 mude durante a eletroforese, mas a composição de aminoácidos não muda.Os peptídeos podem ser quebrados por hidrólise, mas geralmente ainda estão unidos por pontes dissulfeto.O veneno da cascavel oriental contém duas formas de PLA2, chamadas tipo a e tipo p PLA2, respectivamente.A diferença entre esses dois tipos de PLA2 é apenas um aminoácido, ou seja, a glutamina em uma molécula de PLA2 é substituída pelo ácido glutâmico na outra molécula de PLA2.Embora a razão exata para essa diferença não seja clara, geralmente acredita-se que esteja relacionada à desaminação do PLA2.Se o PLA2 no veneno da víbora palestina for mantido aquecido com o veneno bruto, os grupos finais em suas moléculas enzimáticas se tornarão mais numerosos do que antes.De C PLA2 isolado de veneno de cobra tem dois terminais N diferentes, e seu peso molecular é 30.000. e cascavel de diamante ocidental.A cobra asiática é composta de muitas subespécies, algumas das quais não são muito definidas na classificação.Por exemplo, o que costumava ser chamado de subespécie Cobra Outer Caspian agora é reconhecida
Deve ser atribuído à Cobra do Mar Cáspio Exterior.Como existem muitas subespécies e estão misturadas, a composição do veneno de cobra varia muito devido às diferentes fontes, e o conteúdo de isoenzimas PLA2 também é alto.Por exemplo, veneno de cobra
Pelo menos 9 tipos de isoenzimas PLA2 de r ^ ll espécies foram encontrados, e 7 tipos de isoenzimas PLA2 foram encontrados no veneno da subespécie de cobra Caspian.Durkin et ai.(1981) estudaram o conteúdo de PLA2 e o número de isoenzimas em diferentes venenos de serpentes, incluindo 18 venenos de cobra, 3 venenos de mamba, 5 venenos de víbora, 16 venenos de cascavel e 3 venenos de cobra marinha.Em geral, a atividade de PLA2 do veneno de cobra é alta, com muitas isoenzimas.A atividade da PLA2 e as isoenzimas do veneno de víbora são médias.A atividade de PLA2 de veneno de mamba e veneno de cascavel é muito baixa ou nenhuma atividade de PLA2.A atividade PLA2 do veneno de cobra marinha também é baixa.
Nos últimos anos, não foi relatado que o PLA2 no veneno de cobra existe na forma de dímero ativo, como a cascavel rhombófora oriental (o veneno de cobra C. contém PLA2 tipo a e tipo P, ambos compostos por duas subunidades idênticas , e apenas a dimerase tem
Atividade.Shen e outros.também propuseram que apenas o dímero da PLA2 do veneno de cobra é a forma ativa da enzima.O estudo da estrutura espacial também comprova que o PLA2 da cascavel diamondback ocidental existe na forma de dímero.composto piscívoro
Existem dois PLA ^ Ei e E2 diferentes de veneno de cobra, nos quais 仏 existe na forma de dímero, o dímero é ativo e seu monômero dissociado é inativo.Lu Yinghua e outros.(1980) estudou ainda mais as propriedades físicas e químicas e a cinética da reação de E. Jayanthi et al.(1989) isolaram uma PLA2 básica (VRVPL-V) do veneno da víbora.O peso molecular do monômero PLA2 é 10000, que tem efeitos letais, anticoagulantes e edema.A enzima pode polimerizar polímeros com diferentes pesos moleculares sob a condição de PH 4,8, e o grau de polimerização e o peso molecular dos polímeros aumentam com o aumento da temperatura.O peso molecular do polímero gerado a 96 ° C é de 53 100, e a atividade PLA2 deste polímero aumenta em dois
Horário da postagem: 18 de novembro de 2022